کروماتوگرافی – HPLC

کروماتوگرافی – HPLC

کروماتوگرافی – HPLC

HPLC یعنی کروماتوگرافی مایع با فشار زیاد یا کروماتوگرافی مایع با کارکرد عالی است.

HPLC از دو فاز ثابت و متحرک تشکیل شده است. که فاز ثابت جامد و فاز متحرک مایع است.

پیش از دهه 1970 روشهای بسیار کم و غیر قابل اعتمادی جهت کروماتوگرافی در لابراتوارهای دانشمندان وجود داشت.

در طول دهه 1970 بیشتر جداسازی مواد کیمیاوی توسط روشهای متعددی انجام می شده که شامل کروماتوگرافی ستونی ، کروماتوگرافی کاغذی و کروماتوگرافی قشر نازک بوده است. بهر حال این تکنیکهای کروماتوگرافی جهت شناسایی و تعین غلظت بین مواد مشابه و یکسان کافی نبود.در این حین استفاده از روش کروماتوگرافی مایع تحت فشار برای کاهش زمان جداسازی رواج پیدا کرد و کاهش زمان خالص سازی ترکیبات بروش کروماتوگرافی ستونی انجام شد.

توسعه کروماتوگرافی مایع با فشار بالا در اواسط دهه 1970 انجام شد و پیشرفت و تکامل آن مقارن شد با تکامل مواد پک شده درون ستون کروماتوگرافی و همچنین دتکتورهای اتوماتیکی که می توانستند بصورت آنلاین مقدار عبور مایع را محاسبه نمایند.

در اواخر دهه 1970 ، روشهای جدیدی شامل کروماتوگرافی مایع با فاز معکوس این امکان را فراهم کرد تا جداسازی ترکیبات بسیار مشابه ، عملی گردد. در دهه 1980 ، بطور رایجتری از HPLC  برای جداسازی ترکیبات کیمیاوی استفاده می شده است.

تکنیکهای جدید روشهای جداسازی ، شناسایی ، خالص سازی و محاسبه مقدار را متفاوت از گذشته توسعه داد. همچنین برای تسهیل در کار HPLC  ، کامپیوتر و اتوماسیون به سایر روشها اضافه گردید.به مرور تکامل انواع ستونها ، تولید ستونهای بسیار باریک ، ستونهای پیوسته باعث سرعت در کار HPLC  گردید. در دهه گذشته شاهد ظهور میکرو ستونها و ستونهای تخصصی شده برای  HPLC  بوده ایم. قطر معمول میکروستونها یا ستونهای مویی شکل ، حدود µm  3  تا   µm  200 دارد.طول ستونهای HPLC سریع ،  کمتر از ستونهای HPLC  معمولی و برابر mm  3  است و در بخشهای بسیار کوچک در دستگاه HPLC  جاسازی می گردند.هر چند که امروزه HPLC مورد توجه تحقیقات بیوتکنولوژیکی ، کیمیاوی و بیوکیمیاوی و همچنین صنایع دواسازی است اما این موارد فقط   50 درصد  استفاده کنندگان HPLC  را نشان میدهد. ( از کتاب شیمی تجزیه ، جلد 62 ، شماره 19 ، یکم اکتبر 1990 ).در حال حاضر از HPLC در صنایع آرایشی ، غذایی ، تولید انرژی و صنایع زیست محیطی استفاده می شود.

تسوت، گیاه شناس روسی به عنوان کاشف پدیده کروماتوگرافی شناخته شده است. او در اواخر قرن نوزدهم برای جداسازی رنگدانه‌های برگ سبز از یک ستون پرشده با کلسیم کربنات استفاده نمود. پس از او، دانشمندان زیادی در توسعه تئوری و روش کروماتوگرافی نقش داشته‌اند. از جمله مارتین و سینج که به علت توصیف کروماتوگرافی تقسیمی موفق به اخذ جایزه نوبل در سال 1952 شدند. در همان سال مارتین به همراه جیمز روش کروماتوگرافی گاز- مایع را معرفی نمود. تلاش‌ها و کوشش‌های این دانشمندان باعث گردید تا امروزه این روش به عنوان یکی از مهمترین روش‌های کروماتوگرافی در تمامی شاخه‌های شیمی و علوم زیستی مطرح شود.واژه کروماتوگرافی امروزه به دسته‌ای از روش‌ها اطلاق می‌شود که در آنها جداسازی اجزاء موجود در یک نمونه مخلوط، بر اساس تمایل نسبی هر جزء به فاز ساکن هنگام عبور فاز متحرک از روی و یا درون فاز ساکن است. گونه‌ای که تمایل بیشتری به فاز متحرک دارد با سرعت بیشتری حرکت ‌می‌کند و بالعکس گونه‌ای که به فاز ساکن تمایل بیشتری دارد، با سرعت کمتری در طول ستون حرکت می‌کند.به علت آن که مواد با درجات گوناگون به فازهای ساکن تمایل دارند، می‌توان از این خاصیت جهت جداسازی آنها از یکدیگر استفاده نمود. زمان مورد نیاز برای حرکت هر جزء در فاصله مشخص را می‌توان برای تجزیه‌های کیفی به کار برد. همچنین مقدار اندازه‌گیری شده برای هر جزء جدا شده نیز جهت تجزیه کمی سودمند است.

اجزاء و قسمتهای مختلف دستگاه HPLC

گاز کروماتوگرافی مایع با عملکرد عالی (hplc)

1- مخازن محلول :

که در آنها فاز متحرک و یا محلول های شستشو دهنده ستون ریخته شده است.

2- موتور یا پمپ:

چون ستونها نسبتا طویل و اندازه ذرات کم است. به این جهت قابلیت نفوذ کم می شود و برای این که محلول جریان داشته باشد باید فشار وجود داشته باشد. برای ایجاد فشار از پمپ ها استفاده می کنیم. پمپ فشاری حدود psi 4500 می تواند ایجاد کند و باید فشار آن ثابت باشد.

محلول توسط پمپ با جریان ثابتی بر روی فاز ثابت حرکت داده می شود. حداکثر جریانی که فاز متحرک می تواند داشته باشد ۲،۵ملی لیتر در یک دقیقه است. و نظر به نوع کاری که می خواهیم انجام دهیم فلو یا جریان فرق می کند. هر چه جریان کمتر باشد، فاصله پیک ها بیشتر است.

3- انجکتر injector:

از سوزن های مختلف با ظرفیت های مختلف استفاده می کنیم. حجم تزریق ۳- میکرولیتر است. نمونه ابتدا وارد قسمتی بنام گارد کالوم یا پری کالوم می شود که محافظ ستون است، طول کاردکالوم حدو یک سانتی متر است. و جنس آن از فولاد ضد زنگ است، و ماده پرکننده آن از جنس ماده پرکننده ستون است. اگر ماده مورد تشخیص ناخالصی داشته باشد یا با ماده داخل ستون عملیه کیمیاوی ایجاد کند درگاردکالوم انجام می شود و به ستون آسیبی نمی رسد.

4- ستون:

طول ستونهای دستگاه حدود 30-10 سانتی متر است. و جنس آن از فولاد ضدزنگ است. پرمصرف ترین ستون C18 ، ODS آکتا دسیل سیلان است، ستونها را پس از اتمام کار باید با محلولهای شستشو دهنده شست. اگر از بافرفسفات استفاده کردیم ستون را با آب و متیانول و بعد با متیانول خالص شستشو می دهیم.

فاز ثابت بصورت ذرات ریزی در داخل ستون قرار گرفته است که بر اثر چسبیدن و پخش شدن اجزاء نمونه و عبور فاز متحرک جداسازی انجام می شود. نمونه ابتدا وارد گاردکالوم و بعد وارد ستون می شود. ODS اکتا دسیل سیلان گروههای الکیل غیرقطبی زیادی دارد، فاز متحرکی که استفاده می کنیم اکثرا قطبی است. فاز متحرک و ماده پرکننده ستون از نظر قطبیت باید عکس هم باشند.

در HPLC امکان استفاده از فاز نرمال و معکوس هست. اگر فاز ثابت قطبی و فاز متحرک غیرقطبی باشد سیستم را فاز نرمال و در صورتی که ستون غیرقطبی و محلول قطبی باشد درین صورت سیستم را فاز معکوس می گویند. مشتقات آلکیل سیلان و فنیل سیلان ایجاد ستونهای غیر قطبی می کنند و معمولا ستون غیر قطبی و فاز متحرک قطبی است بنابراین از فاز معکوس استفاده می شود. جنس ستونها از فولاد ضدزنگ یا Stainless steel است.

5- دتکتور ها:

دتکتور ها باید حساس باشند و اثر مخرب بر روی اجسام نداشته باشند. پاسخ آنها تا حدود وسیعی برای غلظت باید خطی باشد.

انواع دتکتور ها:

(a)- مهمترین آنها دتکتور ماورا بنفش است که برای اجسامی که در ناحیه UV-VIS جذب داشته باشند مورد استفاده قرار می گیرد. در این دتکتور جذب انجام می شود و باعث کاسته شدن انرژی می شود که این کاسته شدن قابل اندازه گیری است. میزان کاسته شدن انرژی متناسب است با غلظت، باید طول موج را مشخص کنیم که در اینجاnm  λ=225 است. محلول نباید در طول موج انتخابی جذب داشته باشد.

(b)- دتکتور ضریب شکست، این  دتکتور خیلی حساس به حرارت است. از تغییرات یا تفاوتی که بین ضریب شکست سیستم محلول به تنهایی و سیستم محلول همراه نمونه ایجاد می شود استفاده می کنیم. (c)- دتکتور فلورسانس حساس تر از UV است ولی کم استفاده می باشد چون موادی که خاصیت فلورسانس داشته باشند کم هستند.(d)- دتکتور الکتروشیمیایی که عملکرد آن بر مبنای عملیه های اکسید و احیا می باشد.

6- ثبت کننده (ریکاردر):

در اثر حرکات قلم پیک هائی رسم می شود که به مجموعه آنها کروماتوگرام می گویند. به طریق کیفی پیک ها را براساس زمان اقامت یا نگهداری یا Retention time می شناسند. زمان اقامتت فاصله زمانی از لحظه تزریق تا رسیدن به نقطه اوج یک پیک است. برای محاسبه کمی سطح هر نوار جذبی را حساب می کنیم، سطح هر نوار جذبی متناسب با مقدار جسم است که بوسیله انتگراتور یا سطح سنج با دستگاه ثبات بدست می آید سطح هر نوار جذبی یعنی حاصلضرب قاعده و نصف ارتفاع است. روش بریدن نوار و وزن کردن آنها روش قدیمی است ولی امروزه توسط سطح سنج یا انتگراتور بدست می آید خود دستگاه AUC را مشخص می کند. می توان از ارتفاع هم استفاده کرد و نسبت ارتفاع ها را مشخص کنیم AUC و ارتفاع با یک دستور ساده قابل تبدیل بهم هستند.

فاز ساکن و فاز متحرکدر مورد فاز‌های ساکن و متحرک یک قاعده کلی وجود دارد و آن ، این است که باید خاصیت قطبی بودن حل‌شونده و فاز متحرک ، نزدیک به هم باشد، ولی با فاز ساکن اختلاف داشته باشد. ترتیب قطبیت گروه‌های عاملی در ترکیبات به صورت زیر است:هایدروکاربن< ایترها < استرها < کیتن‌ها < الدهایدها < آمیدها < آمین‌ها < الکول‌هابه عنوان مثال ، فاز ساکن با قطبیت بالا مثل سیلیکات یا آلومین یا مایعات قطبی مثل تری‌اتیلن گلیگول که روی ذرات سیلیکات قرار گرفته‌اند و فاز متحرک ، محلول نسبتا غیر قطبی مثل هگزان یا ایزو پروپیل اتر را می‌توان نام برد.

خصوصیات فاز متحرک ( HPLC )خالص بودننقطه جوش حدود 20 تا 50 بالاتر از درجه حرارت ستونچسپناکی کمتعامل پذیری کمقابلیت تطابق با آشکارسازسمیت و اشتعال پذیری کم

مزایای HPLCکاربرد HPLC برای مواد غیر فرار به قرار زیر می‌باشد:از ستون‌های طولانی که سرعت محلول در تمام طول آنها نزدیک به مطلوب‌ترین سرعت باشد، می‌توان استفاده کرد و امکان تغییر دادن ماهیت فاز متحرک برای انجام شستشوی تدریجی و شستشوی مرحله‌ای یا هر دو وجود دارد.

آشکارسازآشکارسازهای مورد استفاده در کروماتوگرافی مایع – مایع تمام خصوصیات آشکارسازهای کروماتوگرافی گازی را دارند، بجز اینکه در آشکارساز کروماتوگرافی مایع نیازی به محدوده حرارت بالا نیست.

حتما بخوانید:

⇐ آشنایی با دستگاه گاز کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC)

⇐ استفاده از دستگاه گازکروماتوگرافی-طیف بینی جرمی در تجزیه آلاینده های هوا

⇐ کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC

⇐ گاز کروماتوگرافی GC

⇐ آشنایی با دستگاه کروماتوگرافی یونی

منبع: دانشجویان بهداشت حرفه ای

   

نویسنده: سیروان شیخی

«تجربه در صنعت»، زیربنایِ اشتیاقِ من به دنیایِ HSE است. با بیش از ۱۳ سال فعالیت اجرایی و تخصصی، هدفم در این وب‌سایت، پل زدن میان دانشِ آکادمیک و نیازهای واقعیِ صنعت است. همراه با تیم تخصصی‌ام، می‌کوشیم تا با ارائه محتوای کاربردی و به‌روز، مسیرِ رشد حرفه‌ای شما را هموارتر کنیم. خوشحال می‌شوم در صفحه لینکدین، تجربیاتمان را به اشتراک بگذاریم و در این مسیر تخصصی همراه هم باشیم.