کروماتوگرافی – HPLC
کروماتوگرافی – HPLC
کروماتوگرافی – HPLC
HPLC يعني كروماتوگرافي مايع با فشار زياد يا کروماتوگرافی مايع با كاركرد عالي است.
HPLC از دو فاز ثابت و متحرك تشكيل شده است. كه فاز ثابت جامد و فاز متحرك مايع است.
پیش از دهه 1970 روشهای بسیار کم و غیر قابل اعتمادی جهت کروماتوگرافی در لابراتوارهای دانشمندان وجود داشت.
در طول دهه 1970 بیشتر جداسازی مواد کیمیاوی توسط روشهای متعددی انجام می شده که شامل کروماتوگرافی ستونی ، کروماتوگرافی کاغذی و کروماتوگرافی قشر نازک بوده است. بهر حال این تکنیکهای کروماتوگرافی جهت شناسایی و تعین غلظت بین مواد مشابه و یکسان کافی نبود.در این حین استفاده از روش کروماتوگرافی مایع تحت فشار برای کاهش زمان جداسازی رواج پیدا کرد و کاهش زمان خالص سازی ترکیبات بروش کروماتوگرافی ستونی انجام شد.
توسعه کروماتوگرافی مایع با فشار بالا در اواسط دهه 1970 انجام شد و پیشرفت و تکامل آن مقارن شد با تکامل مواد پک شده درون ستون کروماتوگرافی و همچنین دتکتورهای اتوماتیکی که می توانستند بصورت آنلاین مقدار عبور مایع را محاسبه نمایند.
در اواخر دهه 1970 ، روشهای جدیدی شامل کروماتوگرافی مایع با فاز معکوس این امکان را فراهم کرد تا جداسازی ترکیبات بسیار مشابه ، عملی گردد. در دهه 1980 ، بطور رایجتری از HPLC برای جداسازی ترکیبات کیمیاوی استفاده می شده است.
تکنیکهای جدید روشهای جداسازی ، شناسایی ، خالص سازی و محاسبه مقدار را متفاوت از گذشته توسعه داد. همچنین برای تسهیل در کار HPLC ، کامپیوتر و اتوماسیون به سایر روشها اضافه گردید.به مرور تکامل انواع ستونها ، تولید ستونهای بسیار باریک ، ستونهای پیوسته باعث سرعت در کار HPLC گردید. در دهه گذشته شاهد ظهور میکرو ستونها و ستونهای تخصصی شده برای HPLC بوده ایم. قطر معمول میکروستونها یا ستونهای مویی شکل ، حدود µm 3 تا µm 200 دارد.طول ستونهای HPLC سریع ، کمتر از ستونهای HPLC معمولی و برابر mm 3 است و در بخشهای بسیار کوچک در دستگاه HPLC جاسازی می گردند.هر چند که امروزه HPLC مورد توجه تحقیقات بیوتکنولوژیکی ، کیمیاوی و بیوکیمیاوی و همچنین صنایع دواسازی است اما این موارد فقط 50 درصد استفاده کنندگان HPLC را نشان میدهد. ( از کتاب شیمی تجزیه ، جلد 62 ، شماره 19 ، یکم اکتبر 1990 ).در حال حاضر از HPLC در صنایع آرایشی ، غذایی ، تولید انرژی و صنایع زیست محیطی استفاده می شود.
تسوت، گياه شناس روسي به عنوان کاشف پديده کروماتوگرافي شناخته شده است. او در اواخر قرن نوزدهم براي جداسازي رنگدانههاي برگ سبز از يک ستون پرشده با کلسيم کربنات استفاده نمود. پس از او، دانشمندان زيادي در توسعه تئوري و روش کروماتوگرافي نقش داشتهاند. از جمله مارتين و سينج که به علت توصيف کروماتوگرافي تقسيمي موفق به اخذ جايزه نوبل در سال 1952 شدند. در همان سال مارتين به همراه جيمز روش کروماتوگرافي گاز- مايع را معرفي نمود. تلاشها و کوششهاي اين دانشمندان باعث گرديد تا امروزه اين روش به عنوان يکي از مهمترين روشهاي کروماتوگرافي در تمامي شاخههاي شيمي و علوم زيستي مطرح شود.واژه کروماتوگرافي امروزه به دستهاي از روشها اطلاق ميشود که در آنها جداسازي اجزاء موجود در يک نمونه مخلوط، بر اساس تمايل نسبي هر جزء به فاز ساکن هنگام عبور فاز متحرک از روي و يا درون فاز ساکن است. گونهاي که تمايل بيشتري به فاز متحرک دارد با سرعت بيشتري حرکت ميکند و بالعکس گونهاي که به فاز ساکن تمايل بيشتري دارد، با سرعت کمتري در طول ستون حرکت ميکند.به علت آن که مواد با درجات گوناگون به فازهاي ساکن تمايل دارند، ميتوان از اين خاصيت جهت جداسازي آنها از يکديگر استفاده نمود. زمان مورد نياز براي حرکت هر جزء در فاصله مشخص را ميتوان براي تجزيههاي کيفي به کار برد. همچنين مقدار اندازهگيري شده براي هر جزء جدا شده نيز جهت تجزيه کمي سودمند است.
اجزاء و قسمتهاي مختلف دستگاه HPLC
گاز کروماتوگرافی مایع با عملکرد عالی (hplc)
1- مخازن محلول :
كه در آنها فاز متحرك و يا محلول هاي شستشو دهنده ستون ريخته شده است.
2- موتور يا پمپ:
چون ستونها نسبتا طويل و اندازه ذرات كم است. به اين جهت قابليت نفوذ كم مي شود و براي اين كه محلول جريان داشته باشد بايد فشار وجود داشته باشد. براي ايجاد فشار از پمپ ها استفاده مي كنيم. پمپ فشاري حدود psi 4500 مي تواند ايجاد كند و بايد فشار آن ثابت باشد.
محلول توسط پمپ با جریان ثابتي بر روي فاز ثابت حركت داده مي شود. حداكثر جریانی كه فاز متحرك مي تواند داشته باشد ۲،۵ملی لیتر در یک دقیقه است. و نظر به نوع كاري كه مي خواهيم انجام دهيم فلو یا جریان فرق مي كند. هر چه جریان كمتر باشد، فاصله پيك ها بيشتر است.
3- انجکتر injector:
از سوزن های مختلف با ظرفيت هاي مختلف استفاده مي كنيم. حجم تزريق ۳- ميكروليتر است. نمونه ابتدا وارد قسمتي بنام گارد كالوم يا پري كالوم مي شود كه محافظ ستون است، طول كاردكالوم حدو يك سانتي متر است. و جنس آن از فولاد ضد زنگ است، و ماده پركننده آن از جنس ماده پركننده ستون است. اگر ماده مورد تشخیص ناخالصي داشته باشد يا با ماده داخل ستون عملیه کیمیاوی ايجاد كند درگاردكالوم انجام مي شود و به ستون آسيبي نمي رسد.
4- ستون:
طول ستونهاي دستگاه حدود 30-10 سانتي متر است. و جنس آن از فولاد ضدزنگ است. پرمصرف ترين ستون C18 ، ODS آکتا دسيل سيلان است، ستونها را پس از اتمام كار بايد با محلولهاي شستشو دهنده شست. اگر از بافرفسفات استفاده كرديم ستون را با آب و متیانول و بعد با متیانول خالص شستشو مي دهيم.
فاز ثابت بصورت ذرات ريزي در داخل ستون قرار گرفته است كه بر اثر چسبيدن و پخش شدن اجزاء نمونه و عبور فاز متحرك جداسازي انجام مي شود. نمونه ابتدا وارد گاردكالوم و بعد وارد ستون مي شود. ODS اكتا دسيل سيلان گروههاي الكيل غيرقطبي زيادي دارد، فاز متحركي كه استفاده مي كنيم اکثرا قطبي است. فاز متحرك و ماده پركننده ستون از نظر قطبيت بايد عكس هم باشند.
در HPLC امکان استفاده از فاز نرمال و معكوس هست. اگر فاز ثابت قطبي و فاز متحرك غيرقطبي باشد سيستم را فاز نرمال و در صورتي كه ستون غيرقطبي و محلول قطبي باشد درین صورت سيستم را فاز معكوس مي گويند. مشتقات آلكيل سيلان و فنيل سيلان ايجاد ستونهاي غير قطبي مي كنند و معمولا ستون غير قطبي و فاز متحرك قطبي است بنابراين از فاز معكوس استفاده می شود. جنس ستونها از فولاد ضدزنگ يا Stainless steel است.
5- دتکتور ها:
دتکتور ها بايد حساس باشند و اثر مخرب بر روي اجسام نداشته باشند. پاسخ آنها تا حدود وسيعي براي غلظت بايد خطي باشد.
انواع دتکتور ها:
(a)- مهمترين آنها دتکتور ماورا بنفش است که براي اجسامي كه در ناحيه UV-VIS جذب داشته باشند مورد استفاده قرار می گیرد. در اين دتكتور جذب انجام مي شود و باعث كاسته شدن انرژي مي شود كه اين كاسته شدن قابل اندازه گيري است. ميزان كاسته شدن انرژي متناسب است با غلظت، بايد طول موج را مشخص كنيم كه در اينجاnm λ=225 است. محلول نبايد در طول موج انتخابي جذب داشته باشد.
(b)- دتکتور ضريب شكست، اين دتکتور خيلي حساس به حرارت است. از تغييرات يا تفاوتي كه بين ضريب شكست سيستم محلول به تنهايي و سيستم محلول همراه نمونه ايجاد مي شود استفاده مي كنيم. (c)- دتكتور فلورسانس حساس تر از UV است ولي كم استفاده مي باشد چون موادي كه خاصيت فلورسانس داشته باشند كم هستند.(d)- دتکتور الكتروشيميايي كه عملکرد آن بر مبنای عملیه های اکسید و احیا می باشد.
6- ثبت کننده (ریكاردر):
در اثر حركات قلم پيك هائي رسم مي شود كه به مجموعه آنها كروماتوگرام مي گويند. به طريق كيفي پيك ها را براساس زمان اقامت يا نگهداري يا Retention time مي شناسند. زمان اقامتت فاصله زماني از لحظه تزريق تا رسيدن به نقطه اوج يك پيك است. براي محاسبه كمي سطح هر نوار جذبي را حساب مي كنيم، سطح هر نوار جذبي متناسب با مقدار جسم است كه بوسيله انتگراتور يا سطح سنج با دستگاه ثبات بدست مي آيد سطح هر نوار جذبي يعني حاصلضرب قاعده و نصف ارتفاع است. روش بريدن نوار و وزن كردن آنها روش قديمي است ولي امروزه توسط سطح سنج يا انتگراتور بدست مي آيد خود دستگاه AUC را مشخص مي كند. مي توان از ارتفاع هم استفاده كرد و نسبت ارتفاع ها را مشخص كنيم AUC و ارتفاع با يك دستور ساده قابل تبديل بهم هستند.
فاز ساکن و فاز متحرکدر مورد فازهای ساکن و متحرک یک قاعده کلی وجود دارد و آن ، این است که باید خاصیت قطبی بودن حلشونده و فاز متحرک ، نزدیک به هم باشد، ولی با فاز ساکن اختلاف داشته باشد. ترتیب قطبیت گروههای عاملی در ترکیبات به صورت زیر است:هایدروکاربن< ایترها < استرها < کیتنها < الدهایدها < آمیدها < آمینها < الکولهابه عنوان مثال ، فاز ساکن با قطبیت بالا مثل سیلیکات یا آلومین یا مایعات قطبی مثل تریاتیلن گلیگول که روی ذرات سیلیکات قرار گرفتهاند و فاز متحرک ، محلول نسبتا غیر قطبی مثل هگزان یا ایزو پروپیل اتر را میتوان نام برد.
خصوصیات فاز متحرک ( HPLC )خالص بودننقطه جوش حدود 20 تا 50 بالاتر از درجه حرارت ستونچسپناکی کمتعامل پذیری کمقابلیت تطابق با آشکارسازسمیت و اشتعال پذیری کم
مزایای HPLCکاربرد HPLC برای مواد غیر فرار به قرار زیر میباشد:از ستونهای طولانی که سرعت محلول در تمام طول آنها نزدیک به مطلوبترین سرعت باشد، میتوان استفاده کرد و امکان تغییر دادن ماهیت فاز متحرک برای انجام شستشوی تدریجی و شستشوی مرحلهای یا هر دو وجود دارد.
آشکارسازآشکارسازهای مورد استفاده در کروماتوگرافی مایع – مایع تمام خصوصیات آشکارسازهای کروماتوگرافی گازی را دارند، بجز اینکه در آشکارساز کروماتوگرافی مایع نیازی به محدوده حرارت بالا نیست.
حتما بخوانید:
⇐ آشنایی با دستگاه گاز کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC)
⇐ استفاده از دستگاه گازکروماتوگرافی-طیف بینی جرمی در تجزیه آلاینده های هوا
منبع: دانشجویان بهداشت حرفه ای
دیدگاهتان را بنویسید
می خواهید در گفت و گو شرکت کنید؟خیالتان راحت باشد :)