کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC

تسوت، گیاه شناس روسی به عنوان کاشف پدیده کروماتوگرافی شناخته شده است. او در اواخر قرن نوزدهم برای جداسازی رنگدانه‌های برگ سبز از یک ستون پرشده با کلسیم کربنات استفاده نمود. پس از او، دانشمندان زیادی در توسعه تئوری و روش کروماتوگرافی نقش داشته‌اند. از جمله مارتین و سینج که به علت توصیف کروماتوگرافی تقسیمی موفق به اخذ جایزه نوبل در سال 1952 شدند. در همان سال مارتین به همراه جیمز روش کروماتوگرافی گاز- مایع را معرفی نمود. تلاش‌ها و کوشش‌های این دانشمندان باعث گردید تا امروزه این روش به عنوان یکی از مهمترین روش‌های کروماتوگرافی در تمامی شاخه‌های شیمی و علوم زیستی مطرح شود.

واژه کروماتوگرافی امروزه به دسته‌ای از روش‌ها اطلاق می‌شود که در آنها جداسازی اجزاء موجود در یک نمونه مخلوط، بر اساس تمایل نسبی هر جزء به فاز ساکن هنگام عبور فاز متحرک از روی و یا درون فاز ساکن است. گونه‌ای که تمایل بیشتری به فاز متحرک دارد با سرعت بیشتری حرکت ‌می‌کند و بالعکس گونه‌ای که به فاز ساکن تمایل بیشتری دارد، با سرعت کمتری در طول ستون حرکت می‌کند.

به علت آن که مواد با درجات گوناگون به فازهای ساکن تمایل دارند، می‌توان از این خاصیت جهت جداسازی آنها از یکدیگر استفاده نمود. زمان مورد نیاز برای حرکت هر جزء در فاصله مشخص را می‌توان برای تجزیه‌های کیفی به کار برد. همچنین مقدار اندازه‌گیری شده برای هر جزء جدا شده نیز جهت تجزیه کمی سودمند است.

کروماتوگرافی با توجه به طبیعت فازهای ساکن و متحرک به دسته‌های مختلفی تقسیم می‌شود. برخی از روش‌های متداول کروماتوگرافی در جدول 1 ذکر شده است.

جدول 1- روش‌های متداول کروماتوگرافی

کروماتوگرافی مایع یکی از انواع کروماتوگرافی است که فاز متحرک در آن مایع است. کروماتوگرافی گازی نیز روش دیگری است که در آن فاز متحرک گاز است. اگر فاز متحرک گاز و فاز ساکن مایع باشد، روش را کروماتوگرافی گاز- مایع می‌نامند. روش‌های کروماتوگرافی گاز- جامد، مایع- مایع و مایع- جامد نیز وجود دارند.

کروماتوگرام، نموداری از پاسخ آشکارساز بر حسب زمان، حجم فاز متحرک یا فاصله است. اطلاعات مفیدی نظیر میزان پیچیدگی نمونه، تعداد اجزاء موجود در نمونه، مشخصات کیفی اجزای نمونه، درک کمی از درصد گونه‌ها موجود در نمونه و مشخصه‌های کارایی ستون، به سادگی از کروماتوگرام قابل حصول هستند.

در HPLC اغلب از ستون‌های پر شده با ذرات ریز فاز ساکن استفاده می‌شود. به همین علت سطح بیشتری از فاز ساکن در ستون در معرض اجزاء نمونه قرار می‌گیرد و در نتیجه راندمان جداسازی در این روش بیشتر از سایر روش‌های کروماتوگرافی است.

در سیستم HPLC با استفاده از یک سوزن مخصوص وارد پیش ستون مربوطه می‌شود. هم‌ زمان از یک حلال مخصوص جهت ترکیب شدن با نمونه استفاده می‌شود. سپس نمونه با حلال مورد نظر ترکیب شده و وارد ستون مربوطه می شود و بر اساس میزان قطبیت حلال و ترکیب از یکدیگر جدا می‌شوند. همچنین نمونه بر اساس زمان بازداری از یکدیگر تفکیک می‌شوند. شکل زیر اجزای یک سیستم HPLC را نشان می‌دهد.

گاز کروماتوگرافی مایع با عملکرد عالی (hplc)

شکل 1- اجزا سیستم HPLC

 کاربردها:

1. جداسازی، خالص سازی و شناسائی پروتئین ها و ترکیبات آلی بویژه ترکیبات داروئی. همچنین در برخی از آزمایش های مربوط به تعیین غلظت داروها مورد استفاده قرار می گیرد .
2. در تحقیقات پروتومیک (تحقیقاتی که برروی پروتئین ها انجام می شود)، آنالیز و هضم پروتئین
3. تعیین ساختار پلیمرها
4. مقایسه ساختارهای پروتئین های مختلف

پیش از دهه 1970 روشهای بسیار کم و غیر قابل اعتمادی جهت کروماتوگرافی در آزمایشگاه های دانشمندان وجود داشت. در طول دهه 1970 بیشتر جداسازی مواد شیمیایی توسط روشهای متعددی انجام می شده که شامل کروماتوگرافی ستونی، کروماتوگرافی کاغذی و کروماتوگرافی لایه نازک بوده است. بهر حال این تکنیکهای کروماتوگرافی جهت شناسایی و تعین غلظت بین مواد مشابه و یکسان کافی نبود.

 در این حین استفاده از روش کروماتوگرافی مایع تحت فشار برای کاهش زمان جداسازی رواج پیدا کرد و کاهش زمان خالص سازی ترکیبات بروش کروماتوگرافی ستونی انجام شد.

  به هر حال شدت جریان مایع درون این ستون ثابت و پایدار نبود و مدتها این سوال مطرح بوده که بهتر نیست این شدت جریان یا فشار ثابت باشد ؟ ( از کتاب شیمی تجزیه ، جلد 62 ، شماره 19 ، یکم اکتبر 1990 ).

توسعه کروماتوگرافی مایع با فشار بالا در اواسط دهه 1970 انجام شد و پیشرفت و تکامل آن مقارن شد با تکامل مواد پک شده درون ستون کروماتوگرافی و همچنین ردیابهای اتوماتیکی که می توانستند بصورت آنلاین مقدار عبور مایع را محاسبه نمایند.

در اواخر دهه 1970، روشهای جدیدی شامل کروماتوگرافی مایع با فاز معکوس این امکان را فراهم کرد تا جداسازی ترکیبات بسیار مشابه، عملی گردد. در دهه 1980، بطور رایجتری از HPLC  برای جداسازی ترکیبات شیمیایی استفاده می شده است.

تکنیک های جدید روش های جداسازی، شناسایی، خالص سازی و محاسبه مقدار را متفاوت از گذشته توسعه داد. همچنین برای تسهیل در کار HPLC، کامپیوتر و اتوماسیون به سایر روشها اضافه گردید.

به مرور تکامل انواع ستونها ، تولید ستونهای بسیار باریک ، ستونهای پیوسته باعث سرعت در کار HPLC  گردید. در دهه گذشته شاهد ظهور میکروستون ها و ستون های تخصصی شده برای HPLC بوده ایم. قطر معمول میکروستون ها یا ستونهای مویی شکل، حدود µm  3 تا µm  200 دارد.

طول ستون های HPLC سریع، کمتر از ستونهای HPLC معمولی و برابر mm 3 است و در بخش های بسیار کوچک در دستگاه HPLC  جاسازی می گردند.

هر چند که امروزه HPLC مورد توجه تحقیقات بیوتکنولوژیکی، شیمیایی و بیوشیمیایی و همچنین صنایع داروسازی است اما این موارد فقط 50 درصد  استفاده کنندگان HPLC  را نشان میدهد. (از کتاب شیمی تجزیه ، جلد 62 ، شماره 19 ، یکم اکتبر 1990 ).

 در حال حاضر از HPLC در صنایع آرایشی، غذایی، تولید انرژی و صنایع زیست محیطی استفاده می شود.

مهمترین قسمت های یک دستگاه HPLC عبارتست از:

1. سیستم انتقال حلال (پمپ)
2. محل تزریق (Injector)
3. ستون
4. آشکارساز
5. کامپیوتر برای ارزیابی دیتاها

حلال ها در HPLC: مهمترین حلالهایی که در HPLC استفاده می شوند عبارتند از: متانل، استونیتریل، آب مقطر، بافرها آب مقطر مورد استفاده باید آب مقطر 2 بار تقطیر باشد و قبل از استفاده حتما با فیلتر های آبی 0.45 میکرون فیلتر شود.

بقیه حلالها باید کیفیت مناسب از نظر خلوص را داشته باشند یا به عبارت دیگر گرید HPLC‌ باشند. بهتر است که جهت اطمینان این حلالها هم قبل از استفاده با فیلترهای آلی 0.45 میکرون فیلتر شوند.

یک نکته مهم اینست که در HPLC حلال های ما باید عاری از گاز هایی مثل اکسیژن باشند که برای این کار از گاز هلیوم با خلوص بسیار بالا استفاده میشود.

ستون: انتخاب نوع ستون بستگی به ماده مورد آزمون دارد و در واقع بر اساس آن انتخاب می شود. ستونها با مواد مختلفی پر میشوند. مثلا ستون C18 از سیلیکاژل اصلاح شده پر شده است.

آشکارساز(Detector): اکثرا از آشکارسازهای UV استفاده می شود.

ارزیابی دیتاها: برای ارزیابی دیتاها نیاز به یک دستگاه کامپیوتر داریم که باید برنامه نرم افزاری مربوط به آن دستگاه HPLC روی کامپیوتر نصب شده باشد.برای ارزیابی دیتاها اغلب از سطح زیر پیکها استفاده میشود نه ارتفاع پیک.

شروع کار با دستگاه: در ابتدا باید مسیر شسته شود و فرض کنیم که نمیدانیم نفر قبلی از چه حلالهایی استفاده کرده است ابتدا مطمئن شوید که ستون از دستگاه جدا شده باشد سپس با اسید نیتریک 30% به مدت 10 دقیقه شستشو دهید سپس 1 ساعت با آب مقطر.

حال می توانید ستون مورد نظرتان را وصل کرده با مخلوط 50:50 متانل و آب شستشو دهید تا جذبی که دستگاه نشان میدهد ثابت بماند. سپس با فاز متحرکی که می خواهید با آن کار کنید را تزریق کنید تا مسیرها و ستون را شستشو دهد تا زمانی که عدد مربوط به جذب ثابت بماند.

وقتی این عدد ثابت ماند به دستگاه اعلام میکنیم که جذب مربوط به فاز متحرک را صفر در نظر بگیرد.

نکات مهم:

• ترتیب روشن کردن قسمت های مختلف دستگاه: کامپیوتر (اگر تنظیمات پمپ با آن انجام می شود)، پمپ، تزریق کننده و سپس آشکارساز.
• بعد از روشن کردن پمپ مطمئن شوید که حلالی که مسیر و ستون را شستشو میدهد پس از انجام وظیفه خود توسط شلنگ مربوطه از سیستم خارج شده و به درون ظرف دور ریز میریزد. اگر چنین نبود به احتمال زیاد در پمپ هوا وجود دارد که به کمک یک سرنگ آنرا خالی کنید.
• هرگز مستقیما فاز متحرک را از بافر به استونیتریل 100% و بالعکس تغییر ندهید چون باعث رسوب نمک بافر در دستگاه می شود.

حتما بخوانید:

⇐ گزارش تجزیه نمونه ها به روش کروماتوگرافی

⇐ آشنایی با دستگاه گاز کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC)

⇐ گاز کروماتوگرافی GC

⇐ دستگاه كروماتوگرافي مايع با عملكرد عالي HPLC